Die Arbeiterin ist der eigentliche Honigmacher. Sie erledigt die Alltagsgeschäfte des Bienenvolkes. Arbeitsbienen entstehen in Gegensatz zu den Drohnen aus befruchteten Eiern, tragen also neben dem mütterlichen auch das väterliche Erbgut in sich. Da die Königin sich auf ihren Hochzeitsflügen mit mehreren Drohnen paart, haben die vielen Arbeitsbienen zwar alle die selbe Mutter, aber oft unterschiedliche Väter! Gut sehen kann man das, wenn sich ein Rassengemisch ergibt, dann gibt es im selben Volk zum Beispiel dunkelgrau-grau-weißgestreifte und Bienen mit gelben Ringeln.
Unter den Arbeiterinnen besteht eine gut organisierte Arbeitsteilung, neben dem Honigsammeln und der Verteidigung des Stockes gehören das Putzen, Aufräumen, die Ammendienste und die Betreuung der Königin ebenso zu ihren Aufgaben wie handwerklichen Tätigkeiten, wie Wabenbau und Honigbereitung. Die Arbeitsaufgabe hängt dabei maßgeblich vom Alter der Biene ab: Nach dem Schlupf putzt die junge Biene die Zellen, um sie für einen erneuten Gebrauch vorzubereiten. Nach einigen Tagen kümmert sie sich dann um den Pollenbrei, den sie an die älteren Bienenmaden verfüttert. In dieser Zeit beginnen die Futtersaftdrüsen zu wachsen, und kurze Zeit später füttert sie dann die jüngsten Maden mit Gelee Royal. Wenn die junge Dame etwa zwei Wochen alt ist, überlässt sie das Füttern den jüngeren Bienen und fängt an, Wachsschüppchen auszuschwitzen und diese als Waben zu verbauen. Noch etwas später bilden sich die Futtersaftdrüsen wieder ganz zurück, sie hört ebenfalls mit dem Wachsschwitzen und Bauen auf übernimmt die Wachtätigkeit an der Türe. Viele Arbeitsbienen beginnen dann auch sofort, nach ein paar Erkundungsflügen, ihre Tätigkeit als Sammelbiene.
So streng, wie es die Lehrmeinung vorsah, ist dieser Ablauf in Wirklichkeit aber nicht geregelt, das Bienenvolk ist hochgradig flexibel was die Anpassung an die Notwendigkeiten angeht. Eine Sammelbiene kann auch auf ihre alten Tage noch mal zur Baubiene werden, falls es die Situation erfordert, und Jungbienen können schneller als normal zur Sammelbiene befördert werden. Eigentlich ist diese Selbstorganisation ja noch viel beeindruckender als eine Entwicklung nach dem Kalender.
Obwohl Arbeitsbienen sich genetisch und auch von ihren Anlagen her nicht von ihrer Königin unterscheiden, sind sie doch in der Regel unfruchtbar. Die Pheromone, die die Stockmutter ausschüttet, verhindert die Aktivierung der Eierstöcke ihrer Töchter. Wenn allerdings die Stockmutter ausfällt und die Bienen es nicht schaffen, eine neue Königin heranzuzüchten, fangen nach einem gewissen Zeitraum einigen Arbeiterinnen damit an, selber Eier zu legen und werden zu Drohnenmütterchen: Da diese Arbeiterinnen sich nie in ihrem Leben mit Drohnen verpaart haben, sind die gelegten Eier ja alle unbefruchtet und werden damit zu Drohnen. Das Volk ist wie der Imker sagt drohnenbrütig und dem Untergang geweiht, bestenfalls besteht seine DNA in der nächsten Generation fort, falls es eine der entstehenden Drohnen schafft eine Königin zu erobern.
Arbeitsbienen werden im Sommer nicht besonders alt, 60 Tage war die landläufige Annahme, heute geht man von deutlich weniger aus. Pflanzenschutzmittel und Monokulturen verursachen zusätzlichen Stress und hinterlassen ihre Spuren im Bienenvolk. Im Sommer sind die Völker bei einer Legeleistung der Königin von bis zu 2000 je Tag Eiern in der Entwicklungsspitze zwischen 30.000 (normal) und 50.000 Individuen (sehr stark) groß. Im August und September ändert sich die Entwicklung der Arbeitsbiene, eine veränderte Fütterung der Arbeiterinnenmaden bewirkt bei den sich nun entwickelnden Bienen eine Speicherung von Eiweiß. Die Gegensatz zu normalen Arbeitsbienen sehr langlebigen Bienen pflegen und sammeln auch nicht mehr. Diese Bienen, der Imker spricht von Winterbienen, haben nur die Aufgabe, mit ihren Fett- und Eiweißpolstern sicher den Winter zu überstehen und im kommenden Frühjahr die erste neue Generation Bienen aufzuziehen, Winterbienen haben dazu eine Lebensdauer von ungefähr sechs Monaten.